氢气治疗抑郁性焦虑症的生理学研究进展

【背景介绍】

重度抑郁症(Major depressive disorder，MDD)是一种普遍性精神障碍，影响全球约 3.5 亿人【1】。患有抑郁症的患者，通常表现出炎症反应，其特征是促炎细胞因子如白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6 (IL-6) 和肿瘤坏死因子 (TNF) 的表达增加【2】。研究发现，促炎细胞因子可引发疾病行为、诱发抑郁样神经内分泌和中枢神经递质的变化，而外界刺激(如声音、环境压力等，亦称应激刺激)，会加剧这种影响，引发更严重的症状【3】。另外，来自临床的证据也反映，外周细胞促炎因子表达上升，会导致人类抑郁症症状【4】。

外围细胞释放促炎因子，通过迷走神经进入大脑，由此引发中枢神经系统的疾病反应【5】;神经损伤通过增加细胞因子的表达，导致抑郁样行为的加重;压力通过促进炎症细胞因子(如大脑中的 IL-1β 基因表达)的上调，来加重这一过程【6】。作为应激反应的主要调节因子，IL-1β 水平影响了氧化应激的严重程度【7】。

促炎细胞因子 IL-1β 的表达和激活，依赖于称为炎性小体(也叫炎症小体)的细胞内蛋白质复合物的组装和激活。在细胞感染或应激时，炎性小体复合物介导 Caspase-1 的激活，以促进 pro-IL-1β 成熟，即IL-1β 的表达【8】。最近发现炎性小体导致的神经炎症通路，与几种CNS(中枢神经系统)疾病有关【9】。最近研究表明，炎症小体激活与重度抑郁症(MDD)存在联系，并表明炎症小体激活可能在抑郁样行为的发展中起到重要作用【10】。此外，NLRP3炎症小体已被确定为缓解神经炎症、治疗MDD的潜在治疗靶点【11】。

【氧化应激与MDD发展的关系】

研究发现，MDD患者的炎症和氧化应激生物标志物表达显著增加【12】。氧化应激是由活性氧 (ROS) 和抗氧化剂之间的体内平衡破坏引起的。抗氧化剂可以通过清除自由基、抑制大脑中的氧化应激途径，防止ROS诱导的神经元损伤。有研究指出，抗氧化剂可以作为抑郁症的候选治疗方法【13】。

氢被证明具有选择性地减少细胞毒性氧自由基功能，可作为疾病预防和治疗中的新型抗氧化剂【14】。目前抗抑郁药，只对不到50%的患者有效，通常伴随着广泛的不良副作用【15】。因此，寻找几乎没有副作用的有效抗抑郁药物，用于MDD的预防性治疗，有着巨大潜力。

【研究过程】

实验动物为从第二军医大学(中国上海)动物中心购买的8周龄雄性BALB/c小鼠在，22±2°C的饲养箱中进行12 小时的明暗循环，并提供食物和水运动自由。小鼠在适应新环境以后，随机分为四组，分别是对照组、应激组，给予自来水;富氢水组、富氢水+应激组，给予富氢水。

分组后，每天两次，为小鼠提供30毫升自来水或富氢水(浓度为0.8ppm)，持续4周。同时，对两组应激组小鼠，采用CUMS模型(经典的抑郁症动物模型)以随机顺序向应激组、富氢水+应激组小鼠施用应激源4周。刺激包括45°倾斜笼子、笼子摇晃、4°C 游泳、升温至45°C、限制活动、潮湿环境、连续照明、剥夺食物和饮水【16】。

蔗糖偏好测试，用以测试抑郁模型小鼠中的快感。在黑暗循环期间，向动物提供自来水和1%蔗糖溶液1小时，蔗糖偏好定义为蔗糖消耗量占总用水量的百分比【17】。

尾部悬挂测试。用以测试抑郁模型小鼠中的焦虑程度。通过尾部悬吊系统测量和分析每只小鼠在5分钟长的悬吊期间的不动时间【18】。完成测试后，对小鼠进行解剖分析。

【结果分析】

1、实验小鼠体重和抑郁程度比较

如上图所示，在4周CUMS模型干预后，饮用富氢水的两组小鼠，体重明均大于饮用自来水的对照小鼠体重。

如上图所示，在蔗糖偏好测试中，普通环境下自来水和富氢水组的小鼠，未表现出限制差异;而GUMS应激模型环境下饲养的小鼠，饮用富氢水的小鼠，快感度明显高于自来水组小鼠。

如上图所示，与对照组相比，应激组小鼠在悬尾试验中表现出显着更长的不动时间。

2、实验小鼠海马和皮质中的IL-1β水平比较

如上图所示，与对照组相比，应激组小鼠海马和皮质中IL-1β水平均显着增加;同时，自来水饲养的应激组小鼠，IL-1β水平增加明显高于富氢水饲养下的应激组小鼠。

3、海马体和前额叶皮层中的Caspase-1活性比较

与其他各种相比，自来水饲养的应激组小鼠，其海马体中caspase-1活性明显增加(图b、图e)表明炎症小体被激活，这种变化同样出现在前额叶皮层中;而经过富氢水饲养的应激组小鼠(富氢水+应激组)，caspase-1活性被明显抑制(图g、图j)。

4、海马体和前额叶皮层中的ROS产生比较

暴露于CUMS环境中的小鼠，在海马中均表现出过量产生ROS(图b、图e) ，这种表现同样出现在前额叶皮层(图g、图j) ;富氢水+应激组和应激组之间的比较所示，富氢水的抗氧化作用，也成功地防止了应激诱导的小鼠大脑中过量ROS的产生。

【结果讨论】

研究表明，体内氧化-还原的稳定状态被破坏，会导致氧化应激增加，并协同诱导破坏性神经炎症，导致抑郁症的发生【11】，而慢性压力会加剧这种反应。CUMS会损害内源性抗氧化系统，引起ROS过度积累，导致脂质过氧化，诱导的神经元损伤，出现抑郁样行为【19】。

富含氢的水已被证明对年龄相关的氧化损伤具有保护作用【20】，可以减少长期压力导致的大脑中的氧化应激积累，有助于预防神经元疾病【21】。

在上面的研究中，我们假设富氢水可以防止抑郁样行为的发展。与其他三组相比，暴露于CUMS的小鼠体重增加较少，并表现出抑郁样行为，例如较低的蔗糖偏好、较长的不动时间。而富氢水显著减轻应激组小鼠表现出的抑郁样行为，这表明富含氢的水会阻止抑郁样行为的发展和进一步恶化。

同时，我们进一步研究了富氢水对抑郁样行为产生有益影响的分子机制。慢性压力导致中枢神经系统中促炎细胞因子(IL-6、TNF 和 IL-1)的过度产生，进而导致神经炎症，这在抑郁症状的病理生理学中起作用【2】。上面的研究提供支持性证据，表明暴露于4周CUMS的小鼠，在海马体和皮质中的IL-1β 蛋白表达显著升高。而富氢水可以有效防止应激诱导的CNS IL-1β 蛋白表达升高，这与之前的报道一致，即用富氢水预处理可以降低血清IL-1β水平【22】。

炎症小体介导的 caspase-1 激活导致 IL-1β 的分泌【23】。富氢水抑制 IL-1β 蛋白水平，源于其对炎症小体活化的抑制作用。CUMS小鼠的海马体和前额叶皮质表现出显著的capase-1 激活，这与我们之前的结果和其他研究人员的报告一致【24、18】。富氢水成功抑制富氢水+应激组小鼠应激诱导的中枢神经系统中caspase-1的激活，这些数据表明，富氢水可以抑制炎症小体的活化。

MDD患者的外周血单核细胞中，经常检测到线粒体超氧化物的产生增加【25】。ROS过度产生是NLRP3炎性小体激活的主要原因【26】。临床上，采用ROS抑制剂，可以干扰导致NLRP3炎性小体表达的启动步骤，并间接阻断NLRP3炎性体活化【27】。暴露于CUMS4周的小鼠，海马体和前额叶皮层的ROS产生显著增加;富氢水抑制了富氢水+应激组小鼠海马体和前额叶皮层中 ROS 的产生。

【研究结论】

总体而言，实验数据表明，应激诱导的中枢神经系统中ROS的产生，在MDD的病理生理学中起重要作用。应激诱导的炎症小体激活，导致海马体和皮质中 IL-1β 水平升高。由 IL-1β 引起的神经炎症和 ROS 的积累，是导致中枢神经系统神经元损伤的关键因素。实验数据进一步支持了炎症小体通路是MDD发病机制中一个很好的靶点的观点。

上面研究表明，氢气作为一种有效的抗氧化剂，对NDD的预防是有效的。未来，富氢水可能会被用作一种新颖、有效和预防性的MDD干预措施。

【参考文献】

【1】Klinedinst, N. J. & Regenold, W. T. A mitochondrial bioenergetic basis of depression. J Bioenerg Biomembr 47, 155–71 (2015).

【2】Adler, U. C., Marques, A. H. & Calil, H. M. Inflammatory aspects of depression. Inflamm Allergy Drug Targets 7, 19–23 (2008).

【3】Anisman, H. & Merali, Z. Cytokines, stress and depressive illness: brain-immune interactions. Ann Med 35, 2–11 (2003).

【4】Dunn, A. J., Swiergiel, A. H. & de Beaurepaire, R. Cytokines as mediators of depression: what can we learn from animal studies? Neurosci Biobehav Rev 29, 891–909 (2005).

【5】Hosoi, T., Okuma, Y. & Nomura, Y. The mechanisms of immune-to-brain communication in inflammation as a drug target. Curr Drug Targets Inflamm Allergy 1, 257–62 (2002).

【6】Norman, G. J. et al. Stress and IL-1beta contribute to the development of depressive-like behavior following peripheral nerve injury. Mol Psychiatry 15, 404–14 (2010).

【7】Goshen, I. & Yirmiya, R. Interleukin-1 (IL-1): a central regulator of stress responses. Front Neuroendocrinol 30, 30–45 (2009).

【8】Schroder, K. & Tschopp, J. The inflammasomes. Cell 140, 821–32 (2010).

【9】Singhal, G., Jaehne, E. J., Corrigan, F., Toben, C. & Baune, B. T. Inflammasomes in neuroinflammation and changes in brain function: a focused review. Front Neurosci 8, 315 (2014).

【10】Iwata, M., Ota, K. T. & Duman, R. S. The inflammasome: pathways linking psychological stress, depression, and systemic illnesses. Brain Behav Immun 31, 105–14 (2013).

【11】Alcocer-Gomez, E. & Cordero, M. D. NLRP3 inflammasome: a new target in major depressive disorder. CNS Neurosci Ther 20,294–5 (2014).

【12】Bakunina, N., Pariante, C. M. & Zunszain, P. A. Immune mechanisms linked to depression via oxidative stress and neuroprogression. Immunology 144, 365–73 (2015).

【13】Xu, Y., Wang, C., Klabnik, J. J. & O’Donnell, J. M. Novel therapeutic targets in depression and anxiety: antioxidants as a candidate treatment. Curr Neuropharmacol 12, 108–19 (2014).

【14】Ohsawa, I. et al. Hydrogen acts as a therapeutic antioxidant by selectively reducing cytotoxic oxygen radicals. Nat Med 13, 688–94 (2007).

【15】Lee, S., Jeong, J., Kwak, Y. & Park, S. K. Depression research: where are we now? Mol Brain 3, 8 (2010).

【16】Peng, Y. L. et al. Inducible nitric oxide synthase is involved in the modulation of depressive behaviors induced by unpredictable chronic mild stress. J Neuroinflammation 9, 75 (2012).

【17】Koo, J. W. & Duman, R. S. IL-1beta is an essential mediator of the antineurogenic and anhedonic effects of stress. Proc Natl Acad Sci USA 105, 751–6 (2008).

【18】Zhang, Y. et al. NLRP3 Inflammasome Mediates Chronic Mild Stress-Induced Depression in Mice via Neuroinflammation. Int J Neuropsychopharmacol 18, 1–8 (2015).

【19】Che, Y. et al. Chronic unpredictable stress impairs endogenous antioxidant defense in rat brain. Neurosci Lett 584, 208–13 (2015).

【20】Tomofuji, T. et al. Effects of hydrogen-rich water on aging periodontal tissues in rats. Sci Rep 4, 5534 (2014).

【21】Nagata, K., Nakashima-Kamimura, N., Mikami, T., Ohsawa, I. & Ohta, S. Consumption of molecular hydrogen prevents the stressinduced impairments in hippocampus-dependent learning tasks during chronic physical restraint in mice. Neuropsychopharmacology 34, 501–8 (2009).

【22】Zhang, J. Y. et al. Protective role of hydrogen-rich water on aspirin-induced gastric mucosal damage in rats. World J Gastroenterol 20, 1614–22 (2014).

【23】Franchi, L., Eigenbrod, T., Munoz-Planillo, R. & Nunez, G. The inflammasome: a caspase-1-activation platform that regulates immune responses and disease pathogenesis. Nat Immunol 10, 241–7 (2009).

【24】Pan, Y., Chen, X. Y., Zhang, Q. Y. & Kong, L. D. Microglial NLRP3 inflammasome activation mediates IL-1beta-related inflammation in prefrontal cortex of depressive rats. Brain Behav Immun 41, 90–100 (2014).

【25】Alcocer-Gomez, E. et al. NLRP3 inflammasome is activated in mononuclear blood cells from patients with major depressive disorder. Brain Behav Immun 36, 111–7 (2014).

【26】Gross, O., Thomas, C. J., Guarda, G. & Tschopp, J. The inflammasome: an integrated view. Immunol Rev 243, 136–51 (2011)

【27】Bauernfeind, F. et al. Cutting edge: reactive oxygen species inhibitors block priming, but not activation, of the NLRP3 inflammasome. J Immunol 187, 613–7 (2011).